SN∕T 5179-2021 二代测序法检测蜚蠊携带细菌性样品制备方法
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1CCB752089BD4A2BB8679FC691AB1633 |
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0.3 |
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8 |
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日期： |
2021-10-24 |
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中华人民共和国出入境检验检疫行业标准,SN/T 5179—2021,中华人民共和国海关总署发 布,ICS 11. 020,CCS C 62,2021-06-18发布2022-01-01实施,二代测序法检测蜚 蠊携带细菌性样品 制备方法,Protocol for sample preparation of cockroach-borne bacteria detection with,next-generation sequencing,I,SN/T 5179—2021,前 言,本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规,定起草,本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口,本文件起草单位：中华人民共和国拱北海关,本文件主要起草人：陈健、邱德义、刘恭源、魏晓雅、刘德星、李婷婷、岳巧云,1,SN/T 5179—2021,二代测序法检测蜚蠊携带细菌性样品,制备 方法,1 范围,本文件规定了蜚蠊携带细菌性样品进行二代测序检测的样本采集、前处理、体内外携带细菌的,收集及基因组DNA 的获取和扩增等操作程序,本文件适用于利用二代测序技术对本底调查或口岸截获的蜚蠊携带未知细菌进行高通量检测鉴,定的样品制备工作,2 规范性引用文件,下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用,文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）,适用于本文件,GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法,GB 19489 实验室 生物安全通用要求,SN/T 2752.4 卫生检疫人员的自我防护规范 第4 部分：实验室人员,SN/T 4278—2015 国境口岸医学媒介昆虫DNA 条形码鉴定操作规程,WS/T 230 临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用,3 术语和定义,下列术语和定义适用于本文件,3.1,引物标记 primer marker,在常规引物5'端加入的一段6～12个随机设计的碱基序列，用于标记并区分特定样品的扩增反应,3.2,标签引物 labeled primer,由引物标记加常规引物两部分构成，每一个样品进行PCR 扩增时需保证使用的一对引物中，至,少有一条与其他样品使用的引物标记不同,3.3,高成功率PCR 酶 high success rate PCR polymerase,可成功扩增普通Taq DNA 聚合酶难以扩增样品的一类新型DNA 聚合酶。针对含多种PCR 扩增抑,制物质的粗样品，该酶具有优良的延伸性。常见的有KOD FX 系列等,4 要求,实验室的生物安全应符合GB 19489 要求，实验室人员防护应符合SN/T 2752.4 要求，实验中用水,2,SN/T 5179—2021,应符合GB/T 6682 要求，PCR 扩增检测应符合WS/T 230、SN/T 4278 要求,进行样本携带细菌的收集处理前，应先完成蜚蠊种类的鉴定,5 仪器设备及试剂耗材,5.1 仪器设备,普通台式离心机（最大相对离心力大于14 000 g）、各量程可调移液器（10 μL、20 μL、100 μL、,200 μL、1 000 μL）、可调式恒温浴、PCR 工作站或者超净工作台、PCR 扩增仪、电泳仪、凝胶成像系,统、冰箱、超低温冰箱等,5.2 试剂耗材,分析纯无水乙醇、0.9% NaCl 溶液、高成功率PCR 酶、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、PCR 反应,缓冲液、琼脂糖、DNA 标准分子量标、核酸染料、TAE 电泳液、双蒸水（ddH2O）等,离心管（10 mL、1.5 mL）、PCR 管（0.2 mL）、各量程的移液器吸头（10 μL、20 μL、100 μL、200,μL、1 000 μL）、一次性无粉手套等,6 蜚蠊的采集、保存和运输,将每只蜚蠊标本单独分装在灭菌的采集管或者50 mL 的离心管中。使用冷藏运输箱（-20 ℃或更,低温度）转运样品。样品送达实验室后，待测样本可放置于-80 ℃冰箱中冷冻30 min。用于转移和处,理标本的镊子和离心管等器械和耗材均需高压灭菌，不易高温、高压灭菌的用75 % 乙醇擦拭灭菌,7 操作程序,7.1 体表携带细菌的收集,取1 只蜚蠊置于10 mL 离心管中，加入3 mL 生理盐水，800 r/min 旋涡振荡30 s，短暂离心。收集,上清液转移至新的10 mL 离心管中，13 800 g 离心2 min。弃上清液，留沉淀。重复以上步骤3 次。将,收集的细菌沉淀物，加入500 μL 生理盐水悬浮后合并，4 ℃保存备用,收集废弃液高压灭菌后丢弃,7.2 体内携带细菌的收集,将7.1 处理后的蜚蠊移入10 mL的灭菌离心管中，加入5 mL 75% 乙醇浸泡5 min，重复3次；将蜚,蠊转移至新的10 mL 的灭菌离心管中，然后加入5 mL 0.9% NaCl 溶液，800 r/min 旋涡振荡30 s，弃上,清液，以上步骤重复3 次,将样本放置在生物安全柜中晾干15 min。用灭菌镊子将样本移入新的 10 mL 离心管中，将标本研,碎成糊状,加入3 mL 生理盐水，800 r/min 旋涡振荡30 s，短暂离心，将上清液转移至新的10 mL 离心管中,13 800 g 离心2 min，弃上清液，留沉淀。重复以上收集步骤3 次，将收集的细菌沉淀物，加入500 μL,生理盐水悬浮后合并，4 ℃保存备用,收集废弃液高压灭菌后丢弃,7.3 细菌基因组DNA 的提取,将装有菌液的离心管13 800 g 离心2 min，转移上清液并高压……
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